专题1 微生物的分离、鉴定和计数
一、刷难关
1．炎炎夏日，某校三位高中生食用冰淇淋后出现腹泻，怀疑冰淇淋中大肠杆菌超标。他们采用滤膜法（滤膜孔径小于大肠杆菌）进行检测，并将滤膜置于伊红—亚甲蓝琼脂培养基 $ (\mathrm{E}\mathrm{M}\mathrm{B} $ 培养基 $ ) $ 中培养，大肠杆菌代谢物可与伊红—亚甲蓝反应，从而观察到深紫色菌落（如图）。下列叙述错误的是（ ）
A． $ \mathrm{E}\mathrm{M}\mathrm{B} $ 培养基可用来鉴别大肠杆菌，大肠杆菌菌落呈深紫色并有金属光泽
B．滤膜法能将样品中的大肠杆菌全部过滤掉，使滤液保持无菌状态
C．实验可设置未接种的培养基作为阴性对照，以排除污染干扰
D．实验需要对同一样品进行多次检测，取平均值作为最终结果
答案：B
解析：伊红—亚甲蓝琼脂培养基 $ (\mathrm{E}\mathrm{M}\mathrm{B} $ 培养基 $ ) $ 可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽， $ \mathrm{A} $ 正确；滤膜法（滤膜孔径小于大肠杆菌）能将样品中的大肠杆菌全部过滤掉，但直径小于滤膜孔径的其他菌会进入滤液，滤液不一定保持无菌状态， $ \mathrm{B} $ 错误；在微生物培养实验中，设置未接种的培养基作为阴性对照，能够检测培养基灭菌是否合格，从而排除对实验结果的干扰， $ \mathrm{C} $ 正确；为了避免偶然因素的影响，实验需要对同一样品进行多次检测，取平均值作为最终结果， $ \mathrm{D} $ 正确。
2．动物肠道中的纤维素降解菌多样性高，但大多未被分离和培养。我国研究人员发明了一种全新的分离纤维素降解菌的方法，具体流程如下图。相关叙述错误的是（ ）
A．实验前对肠道细菌扩大培养时，应摇床培养以增加溶解氧并增大菌体与培养液的接触
B．该方法还需添加氮源、无机盐、水等物质供纤维素分解菌利用
C．过程③中纤维素对细菌有高亲和力，有利于纤维素化磁性纳米颗粒黏附细菌
D．该方法分离菌体的效率与细菌的浓度和纤维素化磁性纳米颗粒的粒径、浓度有关
答案：A
解析：肠道缺少氧气，动物肠道中的纤维素降解菌多数为厌氧型细菌，增加溶解氧会抑制这些微生物的增殖， $ \mathrm{A} $ 错误；该方法以纤维素作为唯一碳源，但纤维素分解菌的生长还需要氮源、无机盐、水等物质，所以还需添加这些物质供纤维素分解菌利用， $ \mathrm{B} $ 正确；结合图示可知，纤维素化磁性纳米颗粒黏附细菌的原因是纤维素对细菌有高亲和力， $ \mathrm{C} $ 正确；该方法分离菌体需要利用纤维素化磁性纳米颗粒吸附细菌，因此该方法分离菌体的效率与细菌的浓度和纤维素化磁性纳米颗粒的粒径、浓度有关， $ \mathrm{D} $ 正确。
3．厨余垃圾在垃圾集中点采用生化 $ + $ 雾化 $ + $ 膜过滤技术处理后，可以达到无污染的标准。为筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，提高“生化”处理的效率，研究人员将厨余垃圾机械化处理后加入装有无菌水的锥形瓶中制备厨余垃圾浸出液，然后进行如图所示操作。下列说法错误的是（ ）
A．厨余垃圾浸出液在接种前通常需要进行高压蒸汽灭菌处理
B．可用稀释涂布平板法将厨余垃圾浸出液接种在 $ \mathrm{X} $ 培养基上
C． $ \mathrm{X} $ 培养基含有淀粉和抗生素， $ \mathrm{Y} $ 培养基是不含琼脂的液体培养基
D．图中降解淀粉最高效的微生物是⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型
答案：A
解析：该实验是为了从厨余垃圾中筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，若在接种前对厨余垃圾浸出液进行高压蒸汽灭菌处理会杀死其中的菌种，导致实验失败， $ \mathrm{A} $ 错误。常用的微生物接种方法包括稀释涂布平板法和平板划线法， $ \mathrm{X} $ 培养基为选择培养基，可用稀释涂布平板法将厨余垃圾浸出液接种在 $ \mathrm{X} $ 培养基上， $ \mathrm{B} $ 正确。本实验目的是筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，故图中 $ \mathrm{X} $ 培养基需要以淀粉为唯一碳源并添加抗生素； $ \mathrm{Y} $ 培养基是液体培养基，用来对筛选的菌种进行扩大培养，其中不含凝固剂琼脂， $ \mathrm{C} $ 正确。淀粉遇碘变蓝色， $ \mathrm{X} $ 培养基加入碘液后，能够分解淀粉的菌落周围会出现透明圈，图中降解淀粉最高效的微生物是⑤（菌落大小与其他几个基本相同，但其形成的透明圈最大）；不同微生物形成的菌落特征不同，可根据菌落特征初步判断微生物类型， $ \mathrm{D} $ 正确。
4．酵母菌的品质影响葡萄酒的产量和质量，研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株，进行了图1所示实验，甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入 $ 100\mathrm{m}\mathrm{L} $ 完全培养基，对瓶中酒精浓度和活菌数量的检测结果如图2。下列说法正确的是（ ）
图1 图2
A．葡萄酒发酵过程中，缺氧、酸性的环境及酵母菌产生的酒精等可抑制所有杂菌的繁殖
B．用稀释涂布平板法计算出葡萄酒过滤液的活菌数约为 $ 6.8×{10}^{9} $ 个/ $ \mathrm{L} $ ，比实际值可能偏小
C．用 $ 95\% $ 酒精对实验者的双手进行消毒，菌种接种过程中的试管口、瓶口等要灼烧灭菌
D．由图2可知，丁瓶中的酵母菌产酒精能力比乙瓶的弱
答案：B
解析：大多数杂菌在缺氧、酸性、有酒精的环境下无法繁殖，但上述环境不能抑制所有杂菌， $ \mathrm{A} $ 错误。根据计算公式可知， $ 1\mathrm{L} $ 葡萄酒过滤液的活菌数约为 $ (62+68+74)÷3÷0.1×{10}^{4}×{10}^{3}=6.8×{10}^{9} $ （个），计数过程中两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以计算所得数目可能比实际值偏小， $ \mathrm{B} $ 正确。实验者的双手用 $ 75\% $ 酒精消毒，不能用 $ 95\% $ 酒精消毒；菌种接种过程中，试管口、瓶口要通过火焰灼烧灭菌， $ \mathrm{C} $ 错误。据图1、2可知，甲中没有酵母菌，为对照组，乙、丙、丁挑取不同的菌落培养，丁瓶的活菌数少于乙瓶，但丁瓶中酒精浓度与乙瓶一致，说明丁瓶酵母菌产酒精能力比乙瓶强， $ \mathrm{D} $ 错误。
5．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，研究发现堆肥温度随时间变化的曲线如图1，从堆肥中筛选分离出能高效降解角蛋白的嗜热菌的流程如图2。回答下列问题：
培养基Ⅰ：水、无机盐、碳源、物质 $ \mathrm{X}\cdots \cdots $
培养基Ⅱ：水、无机盐、碳源、物质 $ \mathrm{X} $ 、物质 $ \mathrm{Y}\cdots \cdots $
（1） 培养基的成分中，物质 $ \mathrm{X} $ 和物质 $ \mathrm{Y} $ 分别是 和 。培养基在接种前需要通过 进行灭菌。
（2） 堆肥样品在图1中 （填“ $ \mathrm{a} $ ”“ $ \mathrm{b} $ ”或“ $ \mathrm{c} $ ”）点取样，最可能筛选到目标菌。图2的接种方法为 。富集培养时，要将锥形瓶放入 $ 25℃ $ 恒温摇床，以 $ 100\mathrm{r}/ \min $ 的转速振荡培养，目的是 。
（3） 经过图2操作后，挑取 进行扩大培养。科研人员挑选出了3株能降解角蛋白的菌种P1、P2和P3，并测得透明圈直径与菌落直径（如图3所示，白色部分表示角蛋白被降解）。应选用 （填“P1”“P2”或“P3”）进行扩大培养，理由是 。
（4） 经过扩大培养后，还应多次筛选。科研人员在筛选过程中发现，当培养基中的角蛋白超过某一浓度时，某菌株对角蛋白的降解量反而下降，可能的原因是 。
答案：（1） 角蛋白；琼脂；高压蒸汽灭菌法（或湿热灭菌法）
（2） $ \mathrm{c} $ ；稀释涂布平板法；使细菌与营养物质充分接触
（3） 单菌落；P1；P1的透明圈直径与菌落直径的比值最大，降解角蛋白的效果最佳
（4） 培养基中角蛋白浓度过高，导致细胞失水，进而抑制菌株的生长和繁殖
解析：（1） 该研究的目的是从堆肥中筛选分离出能高效降解角蛋白的嗜热菌，所以使用以角蛋白为唯一氮源的培养基培养，物质 $ \mathrm{X} $ 为角蛋白。由图2可知，培养基Ⅱ是固体培养基，故物质 $ \mathrm{Y} $ 为琼脂。培养基在接种前要通过高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）进行灭菌。
（2） 筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，即筛选的目标菌要满足两个条件，既要耐高温又要能够高效降解角蛋白，所以在图1中 $ \mathrm{c} $ 点取样，最可能达到目的。在固体培养基表面接种微生物常采用平板划线法和稀释涂布平板法，图2中出现梯度稀释的步骤，接种的方法为稀释涂布平板法。富集培养时，要将锥形瓶放入 $ 25℃ $ 恒温摇床，以 $ 100\mathrm{r}/ \min $ 的转速振荡培养，目的是使细菌与营养物质充分接触，从而有利于微生物生长和繁殖。
（3） 经过图2操作后，挑取单菌落进行扩大培养，培养基上透明圈意味着角蛋白被降解，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明该菌株对角蛋白的降解效果越好，由图3可知，应选用P1菌种。
（4） 在筛选过程中，若培养基中角蛋白浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长和繁殖。
6．养殖场粪便中的某些微生物可使氨氮化合物转化为尿素进而产生 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ ，影响畜禽健康。为筛选粪便中能利用氨氮化合物且减少 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ 产生的微生物，研究人员按图1过程进行了实验。其中A平板为牛肉膏蛋白胨培养基，图2为A、B两个平板的培养结果。
图1 图2
（1） 根据图2中A平板的培养结果可知，过程①采用的接种方法为 ，该结果 （填“能”或“不能”）用来计数培养液中菌株的数量，理由是 。
（2） 过程②是采用灭菌绒布在A平板的菌落上按一下，然后将绒布印在B平板上进行接种培养。与A平板相比，B平板培养基在成分上的不同之处是 。根据培养结果，应筛选菌落 （填“ $ \mathrm{a} $ 、 $ \mathrm{b} $ 、 $ \mathrm{d} $ ”或“ $ \mathrm{c} $ 、 $ \mathrm{e} $ ”）为目标菌株。
（3） 为了降低粪便中 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ 的浓度，改善畜禽的生长环境，养殖场的粪便中应添加菌株 （填“甲”或“乙”），理由是 。
答案：（1） 稀释涂布平板法；不能；平板上的菌落数量过少，计数应选择某稀释度下菌落数量为 $ 30\sim 300 $ 的平板
（2） 以尿素为唯一氮源； $ \mathrm{c} $ 、 $ \mathrm{e} $
（3） 乙；乙自身代谢过程中不产生 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ ，而且能够分泌脲酶抑制剂抑制粪便中其他微生物产生 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $
解析：（1） $ \mathrm{A} $ 平板上菌落均匀分布，因此可以判断过程①的接种方法为稀释涂布平板法。计数应选择某稀释度下菌落数量为 $ 30～300 $ 的平板，而 $ \mathrm{A} $ 平板的菌落数量过少，因此该结果不能用来计数培养液中菌株的数量。
（2） 过程②是采用灭菌绒布在 $ \mathrm{A} $ 平板的菌落上按一下，然后将绒布印在 $ \mathrm{B} $ 平板上进行接种培养，这种方法为影印法。与 $ \mathrm{A} $ 平板（完全培养基）相比， $ \mathrm{B} $ 平板（选择培养基）培养基在成分上的不同之处是以尿素为唯一氮源，通常只有能利用尿素的微生物才能在该平板上生长。本实验是筛选不能利用尿素的菌株，根据图2中的结果，不能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长，而能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株 $ \mathrm{c} $ 、 $ \mathrm{e} $ 可用于后续的实验。
（3） 养殖场的粪便中应添加菌株乙，理由是菌株乙自身代谢过程中不产生 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ ，而且能够分泌脲酶抑制剂抑制粪便中其他微生物产生 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ 。因此，添加菌株乙可以降低粪便中 $ {\mathrm{N}\mathrm{H}}_{3} $ 的浓度，从而改善畜禽的生长环境。
7．杨梅具有很高的营养价值，其鲜果也是酿酒的良好材料。发酵型果酒品质取决于所选择的酵母性能。科研人员为挖掘某杨梅主产区的酵母资源，筛选出酒精转化率高、酒精耐受性强的优质杨梅酿酒酵母，进行的研究如图所示。请回答下列问题：
（1） 图1中过程②③④⑤所用培养基为适于酵母菌生长的 $ \mathrm{Y}\mathrm{P}\mathrm{D} $ 培养基，其成分包括 $ 1\% $ 酵母膏、 $ 2\% $ 蛋白胨、 $ 2\% $ 葡萄糖等，其中能提供氮源的有 ；与过程②所用培养基相比，过程③所用培养基中还添加了 。
（2） 过程③梯度稀释时，先分别向A、B、C三支试管中加入 $ \mathrm{m}\mathrm{L} $ 无菌水，再依次加入酵母菌培养液或稀释液 $ 1\mathrm{m}\mathrm{L} $ ，摇匀。取多种稀释倍数的酵母菌培养液 $ 0.1\mathrm{m}\mathrm{L} $ 分别接种到多个平板上，这样做的目的是 ；科研人员在 $ {10}^{5} $ 稀释倍数下操作得到的结果：涂布4个平板，统计的菌落数分别是152、161、179、188，则 $ 1\mathrm{m}\mathrm{L} $ 酵母菌培养液中含有的酵母菌数量约为 个。
（3） 过程④中，用接种环在固体培养基的表面连续划线的目的是 ，每次划线前都要对接种环进行灼烧的目的是 。图1中接种环灼烧的总次数应为 次。划线后将培养皿 ，放入恒温培养箱中培养。
（4） 分离获得的酵母菌还需要经过多级筛选才能获得理想菌株。科研人员利用 $ \mathrm{D}\mathrm{Y}5 $ 、 $ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ 、 $ \mathrm{J}\mathrm{W}14 $ 三种菌株，发酵制作杨梅酒，并进行酒精耐受性检测，结果如表及图2所示，三种菌株中，最适于杨梅果酒发酵的是 ，理由有 。
菌株名称 | 酒精度/ $ \% $ | 总糖/ $ (\mathrm{g}\cdot {\mathrm{L}}^{-1}) $ | 总酸/ $ (\mathrm{g}\cdot {\mathrm{L}}^{-1}) $ |
$ \mathrm{D}\mathrm{Y}5 $ | 7.0 | 34.23 | 12.045 |
$ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ | 9.0 | 15.01 | 12.675 |
$ \mathrm{J}\mathrm{W}14 $ | 6.5 | 33.64 | 12.099 |
注：杨梅汁总糖为 $ 78.80\mathrm{g}\cdot {\mathrm{L}}^{-1} $ ，总酸为 $ 10.737\mathrm{g}\cdot {\mathrm{L}}^{-1} $
答案：（1） 酵母膏、蛋白胨；琼脂
（2） 9；获得菌落数量合适的平板，并排除偶然因素造成的误差； $ 1.7×{10}^{8} $
（3） 将聚集的菌种逐步稀释分散获得单菌落；杀死接种环上的微生物；6；倒置
（4） $ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ ；酒精转化率高、酒精耐受力强
解析：（1） 酵母膏和蛋白胨营养丰富，含有糖、有机氮、维生素等，所以酵母膏和蛋白胨可以为酵母菌提供碳源、氮源、维生素等。过程②用的是液体培养基，过程③使用的是固体培养基，所以过程③的培养基比过程②的培养基多了琼脂。
（2） 获得纯净的微生物培养物的关键是无菌技术，因此梯度稀释时应使用无菌水，先分别向 $ \mathrm{A} $ 、 $ \mathrm{B} $ 、 $ \mathrm{C} $ 三支试管中加入 $ 9\mathrm{m}\mathrm{L} $ 无菌水，再依次加入酵母菌培养液或稀释液 $ 1\mathrm{m}\mathrm{L} $ ，摇匀。取多种稀释倍数的酵母菌培养液 $ 0.1\mathrm{m}\mathrm{L} $ 分别接种到多个平板上，这样做的目的是获得菌落数量合适的平板，并排除偶然因素造成的误差。根据科研人员统计的数据进行计算， $ 1\mathrm{m}\mathrm{L} $ 酵母菌培养液中含有的酵母菌数量约为 $ (152+161+179+188)÷4÷0.1×{10}^{5}=1.7×{10}^{8} $ （个）。
（3） 接种时，利用平板划线法可将聚集的菌种逐步稀释分散获得单菌落，需要用接种环在固体培养基的表面多次连续划线；每次划线前和全部划线结束后都要对接种环进行灼烧，以杀死接种环上的微生物。图中过程④共进行5次划线，所以需要对接种环进行灼烧的次数为6次。为避免冷凝水滴落到培养基上，也避免培养基表面水分蒸发过快，划线后应将培养皿倒置，放入恒温培养箱中培养。
（4） 由题表可知，经 $ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ 发酵的杨梅酒酒精度最高，总糖最少，酒精转化率高，由图2可知， $ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ 对酒精的耐受力最强，所以最适于杨梅果酒发酵的是 $ \mathrm{R}\mathrm{Y}1 $ 。