第1节 重组DNA技术的基本工具

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因此通过基因工程，人类可以定向地改变生物性状， $ \mathrm{A} $ 正确；基因工程是在 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 技术， $ \mathrm{B} $ 正确；基因工程可以打破物种界限，实现遗传物质横向转移，在分子水平上定向改变生物的遗传特性， $ \mathrm{C} $ 正确；几乎所有生物共用同一套遗传密码，基因的表达遵循中心法则，因此遗传物质作用方式的相似性是转基因技术的基础， $ \mathrm{D} $ 错误。

基因工程的最终目的是定向地改造生物的遗传性状，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品， $ \mathrm{D} $ 符合题意。

$ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键， $ \mathrm{A} $ 、 $ \mathrm{D} $ 错误。在基因工程中， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶作用于两个黏性末端或两个平末端， $ \mathrm{B} $ 错误。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶与 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶作用的部位相同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键；两者作用对象不同， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶作用于两个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶可使游离的脱氧核苷酸连接到 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段上， $ \mathrm{C} $ 正确。

$ Eco\mathrm{R}Ⅴ $ 切割 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 产生的是平末端，平末端用 $ E.coli\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶连接的效率较低， $ \mathrm{A} $ 正确；两种限制酶均能识别 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的特定序列，并切割磷酸二酯键， $ \mathrm{B} $ 错误；由图可知， $ Eco\mathrm{R}Ⅴ $ 和 $ Xho $ Ⅰ切割 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段分别产生平末端和黏性末端， $ \mathrm{C} $ 错误； $ Xho $ Ⅰ切割 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 产生的末端是黏性末端， $ \mathrm{T}4\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶可用于连接黏性末端和平末端， $ \mathrm{D} $ 错误。

由题图可知， $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 、 $ Bgl $ Ⅱ、 $ Mbo $ Ⅰ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶， $ \mathrm{A} $ 错误；根据相关限制酶的识别序列和切割位点可知，由于 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 的识别序列包含 $ Mbo $ Ⅰ的识别序列，所以当目的基因编码区内有 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 识别序列时，使用 $ Mbo $ Ⅰ切割也会破坏目的基因， $ \mathrm{B} $ 错误； $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 、 $ Bgl $ Ⅱ的识别序列不同，但会产生相同的黏性末端，若用二者切割目的基因，不能防止目的基因自身的环化， $ \mathrm{C} $ 错误；用 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶将 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Bgl $ Ⅱ形成的黏性末端连接后，不能被二者切开，但可再被图中限制酶 $ Mbo $ Ⅰ切开， $ \mathrm{D} $ 正确。

（1） 由于质粒在切割前是一个环状 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子，因此没有游离的磷酸基团，质粒被 $ Sma $ Ⅰ切割,断开磷酸二酯键后形成了两条单链各有1个游离的磷酸基团的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，此时共有2个游离的磷酸基团； $ Sma $ Ⅰ切割后形成的是平末端。

（2） 用 $ Sma $ Ⅰ切割，会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的目的基因，导致重组质粒构建失败。

（3） 目的基因和质粒的化学本质都是 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，因此形成的重组质粒的化学本质也是 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ；为了使目的基因和质粒相连，需要用到 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶。

质粒是一种裸露的、结构简单的环状双链 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子，独立于原核细胞拟核 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 或真核细胞细胞核之外， $ \mathrm{A} $ 正确， $ \mathrm{C} $ 错误；在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的， $ \mathrm{B} $ 错误；质粒一般相对分子质量较小，便于携带 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段进入受体细胞， $ \mathrm{D} $ 错误。

作为载体必须具备的条件之一是具有限制酶切割位点，以利于目的基因插入其中， $ \mathrm{A} $ 正确；作为载体必须具备的条件之一是具有特殊标记基因以利于重组后进行重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的筛选， $ \mathrm{B} $ 错误；作为载体必须具备的条件之一是能在受体细胞稳定保存并复制以利于目的基因的保存和复制， $ \mathrm{C} $ 正确；作为载体，要对受体细胞没有危害以避免影响受体细胞的正常生命活动， $ \mathrm{D} $ 正确。

若只加蒸馏水，由于细胞壁的存在，细胞不会吸水涨破，故不能将 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 释放出来， $ \mathrm{A} $ 错误； $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，这一原理常被用于初步分离蛋白质和 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，上清液中加入预冷的酒精会使 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 析出， $ \mathrm{B} $ 错误；在鉴定 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 时，将丝状物先置于 $ 2\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-1} $ 的 $ \mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{C}\mathrm{l} $ 溶液中溶解，再加入二苯胺试剂，（置于沸水中）加热一段时间才可观察到实验现象， $ \mathrm{C} $ 正确， $ \mathrm{D} $ 错误。

$ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 的识别序列中包含 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 的识别序列，故能被 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 识别并切割的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 也能被 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 识别和切割， $ \mathrm{A} $ 正确； $ Hin\mathrm{c}Ⅱ $ 、 $ Sma $ Ⅰ切割后形成的是平末端， $ \mathrm{T}4\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶可以连接具有平末端的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段， $ \mathrm{B} $ 正确；有些限制酶的识别序列只有一种，有些限制酶的识别序列有多种，如限制酶 $ Hin\mathrm{c}Ⅱ $ 的识别序列为 $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{Y}↓\mathrm{R}\mathrm{A}\mathrm{C}-3\prime $ ，其中 $ \mathrm{Y} $ 为 $ \mathrm{C} $ 或 $ \mathrm{T} $ ， $ \mathrm{R} $ 为 $ \mathrm{A} $ 或 $ \mathrm{G} $ ，其识别序列有多种， $ \mathrm{C} $ 正确； $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 切割后产生的黏性末端相同，因此能够相连，连接后仍然存在 $ \mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C} $ 序列，能被 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 识别，但不一定存在 $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}-3\prime $ 序列，若存在该序列则能被 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 识别， $ \mathrm{D} $ 错误。

$ \mathrm{a} $ 酶可以把线性 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子切成4段，说明该 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子上有3个 $ \mathrm{a} $ 酶切割位点，即 $ \mathrm{a} $ 酶的识别序列有3个；由题图可知 $ \mathrm{b} $ 酶与 $ \mathrm{a} $ 酶的识别序列不同，由表可知 $ \mathrm{b} $ 酶在 $ \mathrm{a} $ 酶切割后，又把大小是 $ 2100\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 切成大小分别为 $ 1900\mathrm{b}\mathrm{p} $ 和 $ 200\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的两个片段，再把大小是 $ 1400\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 切成大小分别为 $ 800\mathrm{b}\mathrm{p} $ 和 $ 600\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的两个片段，再把大小是 $ 500\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 切成大小分别为 $ 300\mathrm{b}\mathrm{p} $ 和 $ 200\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的两个片段，说明该 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子上有3个 $ \mathrm{b} $ 酶切割位点，即 $ \mathrm{b} $ 酶的识别序列有3个， $ \mathrm{A} $ 正确。由题图可知， $ \mathrm{a} $ 酶与 $ \mathrm{b} $ 酶切出的黏性末端相同，用 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶可以将它们连接起来， $ \mathrm{B} $ 正确。限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键，故 $ \mathrm{a} $ 酶与 $ \mathrm{b} $ 酶切断的化学键相同， $ \mathrm{C} $ 正确。质粒为环状 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子，故用 $ \mathrm{a} $ 酶切割与该线性 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 具有相同碱基序列的质粒，可能得到3种切割产物， $ \mathrm{D} $ 错误。

（1） 限制酶能切割外源 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，不能切割原核细胞自身的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，原因可能是原核细胞 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中不存在自身限制酶的识别序列或其识别序列被修饰了。

（2） 若某链状 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子中含有两个 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 的识别序列，用限制酶 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 切割后，该 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子将被切成3个片段，每个酶切位点被切割的过程中会断裂2个磷酸二酯键，共断裂4个磷酸二酯键。

（3） 结合表中信息， $ Bcl $ Ⅰ切割后产生的末端见答案。

（4） $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Bcl $ Ⅰ切割后产生的黏性末端相同，故这两种限制酶切割后产生的黏性末端能被 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶连接。

（5） 不同生物的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 具有相同的基本组成单位，即四种脱氧核苷酸；双链 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的空间结构相同，均为双螺旋结构；不同生物的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子都遵循碱基互补配对原则。因此，不同生物的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子能在相关酶的催化下拼接起来。

（1） 由于花菜等植物的细胞含有细胞壁，可在研磨过程中加入适量的纤维素酶和果胶酶，使研磨效果更好。

（2） 可将获取的样品研磨液直接倒入塑料离心管中，然后进行离心处理，再取上清液放入烧杯中。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，因此可加入体积分数为 $ 95\% $ 的预冷酒精溶液来初步提取 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 。

（3） 将 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 粗提取物溶于 $ 2\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-1} $ 的 $ \mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{C}\mathrm{l} $ 溶液中，加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下进行鉴定。

（4） 见题图解读。