第2节 基因工程的基本操作程序

目的基因是指用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因，也可以是编码具有调控作用的因子的基因等， $ \mathrm{A} $ 错误。

$ Taq\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶与普通 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶的作用相同，都是催化子链延伸， $ \mathrm{A} $ 错误；根据 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 反应体系的配方，一般是加入4种脱氧核苷酸的等量混合液， $ \mathrm{B} $ 正确；引物与 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 单链结合是在复性时，温度是 $ 50℃ $ 左右， $ \mathrm{C} $ 错误；引物的碱基序列特异性决定了 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 过程中扩增的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列区间，即引物决定了 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 过程的特异性扩增， $ \mathrm{D} $ 错误。

如果引物 $ \mathrm{A} $ 和引物 $ \mathrm{B} $ 发生碱基互补配对则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物 $ \mathrm{A} $ 与引物 $ \mathrm{B} $ 之间不能发生碱基互补配对， $ \mathrm{A} $ 正确。复性的目的是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 结合， $ \mathrm{B} $ 正确。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 复制为半保留复制，第二轮循环即 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 复制2次，共形成4个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子，其中含有最初模板链的2个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子含有引物 $ \mathrm{A} $ 或引物 $ \mathrm{B} $ 的序列，其余2个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子均含有引物 $ \mathrm{A} $ 和引物 $ \mathrm{B} $ ， $ \mathrm{C} $ 正确。引物 $ \mathrm{A} $ 和引物 $ \mathrm{B} $ 的结合序列均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，可推知第二轮中也不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段， $ \mathrm{D} $ 错误。

启动子是 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶识别和结合的部位，能启动转录过程， $ \mathrm{A} $ 正确。若 $ \mathrm{b} $ 表示终止子，其具有终止转录的作用；终止密码子位于 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上，作用是使翻译停止， $ \mathrm{B} $ 错误。限制酶切割位点供外源基因插入载体中，便于构建基因表达载体，载体中可能含有多个限制酶切割位点， $ \mathrm{C} $ 正确。若 $ \mathrm{d} $ 表示复制原点，则其能使载体在受体细胞中进行自我复制， $ \mathrm{D} $ 正确。

启动子位于基因上游，是 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录，而密码子位于 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上， $ \mathrm{A} $ 错误；有些不同种限制酶切割后能产生相同的黏性末端，构建基因表达载体时，可以用这些不同种限制酶切割含有目的基因的片段和载体， $ \mathrm{B} $ 正确；转录时 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶沿着转录模板链的 $ 3\prime $ 端向 $ 5\prime $ 端移动，因此构建基因表达载体时，目的基因的转录模板链的 $ 3\prime $ 端应与启动子连接， $ \mathrm{C} $ 错误；基因表达载体上的抗生素抗性基因常用于重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的筛选， $ \mathrm{D} $ 错误。

目的基因必须插入启动子和终止子之间才能进行表达， $ \mathrm{A} $ 正确。目的基因和质粒的连接要用到 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶， $ \mathrm{B} $ 正确。切割图中目的基因和质粒时只要形成的黏性末端相同，就可以将二者连接，不一定要选用相同的限制酶， $ \mathrm{C} $ 错误。结合图1、2和表格，图中 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 的酶切位点位于目的基因内， $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 的酶切位点位于标记基因内， $ NheⅠ $ 在质粒上无相应识别序列，且其他酶与 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Nhe $ Ⅰ产生的黏性末端不同，故切割目的基因应选 $ MfeⅠ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ ；质粒上无 $ MfeⅠ $ 的酶切位点，但 $ MfeⅠ $ 与 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 切出的黏性末端相同，故可选 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 切割质粒， $ \mathrm{D} $ 正确。

用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相同， $ \mathrm{A} $ 错误；若只使用 $ SmaⅠ $ 切割质粒和含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长， $ \mathrm{B} $ 错误；若选择 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ SmaⅠ $ 切割质粒和含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因，能在含四环素的培养基中生长的受体菌有可能导入了重组质粒，也有可能导入了空质粒， $ \mathrm{C} $ 错误；含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段上有 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 的识别序列但没有 $ BclⅠ $ 的识别序列，不能使用 $ BclⅠ $ 切割含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，因为 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 切割后产生的黏性末端与 $ BclⅠ $ 切割后产生的黏性末端相同，故若用 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 和 $ BclⅠ $ 切割质粒，则需用 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 和 $ Sau3\mathrm{A}Ⅰ $ 切割含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段， $ \mathrm{D} $ 正确。

将目的基因导入裸子植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法， $ \mathrm{A} $ 错误；植物的受体细胞可以是受精卵，也可以是叶肉细胞等体细胞， $ \mathrm{B} $ 正确；将目的基因导入大肠杆菌一般需要先用 $ {\mathrm{C}\mathrm{a}}^{2+} $ 处理大肠杆菌，使其处于感受态， $ \mathrm{C} $ 错误；获得乳腺生物反应器需要将药用蛋白基因与乳腺特异性启动子连接后导入哺乳动物受精卵，而非直接导入乳腺细胞， $ \mathrm{D} $ 错误。

目的基因两侧分别有限制酶 $ SmaⅠ $ 和 $ PstⅠ $ 的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶 $ PstⅠ $ 、 $ SmaⅠ $ 对含目的基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 进行切割， $ \mathrm{A} $ 正确；将目的基因导入植物细胞，常用花粉管通道法或农杆菌转化法， $ \mathrm{B} $ 错误；过程③为植物组织培养，不需要用纤维素酶和果胶酶处理， $ \mathrm{C} $ 错误；过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，不能说明转基因成功，转基因成功的标志是目的基因成功表达并出现相应性状， $ \mathrm{D} $ 错误。

可采用分子杂交技术检测目的基因是否转录出了 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，若转录成功，则会出现杂交带， $ \mathrm{A} $ 正确；用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，可检测目的基因是否翻译成蛋白质，若有相应蛋白质合成，则会出现相应的条带， $ \mathrm{B} $ 正确；显微镜下无法看到基因，检测受体细胞是否导入了目的基因可以用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术， $ \mathrm{C} $ 错误；从个体层面，做抗虫或抗病的接种实验可检测转基因生物是否具有抗性以及抗性的程度， $ \mathrm{D} $ 正确。

插入外源基因的细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，故外源基因插入位置是 $ \mathrm{c} $ ， $ \mathrm{A} $ 错误。插入外源基因的细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；不能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，故外源基因插入位置是 $ \mathrm{b} $ ， $ \mathrm{B} $ 正确， $ \mathrm{C} $ 错误。插入外源基因的细菌在含氨苄青霉素的培养基上不能生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏，故外源基因插入位置是 $ \mathrm{a} $ ， $ \mathrm{D} $ 错误。

$ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增 $ PAcA $ 基因时需要以4种脱氧核糖核苷酸为原料， $ \mathrm{A} $ 正确；在琼脂糖凝胶电泳中， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的大小和构象不同，电泳迁移速率不同，因此 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 产物， $ \mathrm{B} $ 正确； $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 复制时，子链是沿着引物的 $ 3\prime $ 端继续合成的，且引物与母链结合遵循碱基互补配对原则，因此 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增 $ PAcA $ 基因时的引物组合是 $ 3\prime -\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}-5\prime $ 和 $ 3\prime -\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{C}-5\prime $ ， $ \mathrm{C} $ 错误； $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增过程的基本条件包括 $ PAcA $ 基因（模板）、4种脱氧核苷酸（原料）、耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶、引物、缓冲液（含 $ {\mathrm{M}\mathrm{g}}^{2+} $ ）等， $ \mathrm{D} $ 正确。

将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 $ 1\mathrm{m}\mathrm{m} $ 为宜， $ \mathrm{A} $ 错误；在凝胶中 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的大小和构象等有关， $ \mathrm{B} $ 错误；电泳时间过长可能会导致 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 跑出凝胶或条带模糊等，反而会降低分离效果， $ \mathrm{C} $ 错误； $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 得到的产物需要与凝胶载样缓冲液混合后方可用于电泳， $ \mathrm{D} $ 正确。

启动子和复制原点均位于 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子上，是相应的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列，起始密码子位于 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上，是相应的 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列， $ \mathrm{A} $ 正确；由该质粒的限制酶识别位点可知，用 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 切割质粒会破坏标记基因，用 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 切割质粒会破坏复制原点，因此应选择 $ SmaⅠ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 切割质粒， $ \mathrm{B} $ 正确；启动子是 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶识别和结合的部位，驱动相关基因转录出相应的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ， $ \mathrm{C} $ 错误；该质粒中标记基因的作用是便于重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的筛选， $ \mathrm{D} $ 正确。

$ ①\to ② $ 利用两种不同限制酶处理，能避免含抗虫基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段自身环化， $ \mathrm{A} $ 正确； $ ②\to ③ $ 可用氯化钙处理农杆菌，使之处于易吸收周围环境中 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的生理状态，这样有助于促进重组 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒转入农杆菌细胞中， $ \mathrm{B} $ 正确； $ ③\to ④ $ 用农杆菌侵染植物细胞，重组 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒上的 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段整合到植物细胞的染色体 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上， $ \mathrm{C} $ 错误； $ ④\to ⑤ $ 利用植物组织培养技术，原理是植物细胞的全能性， $ \mathrm{D} $ 正确。

若从该 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段中直接获取蛛丝蛋白基因， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 每条链上会破坏2个磷酸二酯键，共会破坏4个磷酸二酯键， $ \mathrm{A} $ 正确；由于 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶只能从引物的 $ 3\prime $ 端延伸子链，图中的磷酸基团端为 $ 5\prime $ 端，羟基端为 $ 3\prime $ 端，子链和模板链反向平行，因此根据子链的延伸方向可知，图中与引物结合的部位是2、3， $ \mathrm{B} $ 错误；若受体细胞为大肠杆菌，先用 $ {\mathrm{C}\mathrm{a}}^{2+} $ 处理使其成为感受态细胞，容易从周围环境吸收 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子， $ \mathrm{C} $ 正确；复性温度过低可能造成引物与模板错配，引物与模板的结合位点增加，可能会导致 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增产物不止一种，电泳结果出现不止一条条带， $ \mathrm{D} $ 正确。

复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物和模板链错配形成双链， $ \mathrm{A} $ 正确;电泳时 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子迁移的速率与 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的大小和构象等有关，如电泳一段时间后，较大的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子迁移距离大，离加样孔远， $ \mathrm{B} $ 正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与目的基因相应位置配对，因此不管目的基因正向连接还是反向连接，均会扩增出 $ 450\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的片段， $ \mathrm{C} $ 错误；选取引物乙、丙，扩增出 $ 350\mathrm{b}\mathrm{p} $ 的片段时，可以说明目的基因正向连接，若反向连接，则不能扩增出有效片段， $ \mathrm{D} $ 正确。

根据 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 $ \mathrm{L} $ 到 $ \mathrm{R} $ 的方向为 $ 5\prime \to 3\prime $ ，图中①②链均可作为子链合成的模板， $ \mathrm{A} $ 错误； $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 过程通过高温处理使双链中氢键断裂解聚成为单链，不需要解旋酶， $ \mathrm{B} $ 错误；以1个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 为模板经3次循环产生的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子数目为 $ {2}^{3}=8 $ ，需消耗引物③的数目为 $ (8×2-2)÷2=7 $ ， $ \mathrm{C} $ 错误；引物③（ $ 5\prime $ 端添加了某序列）与模板 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子内部碱基互补配对，至少需经2次循环才可获得含该序列的双链 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 产物， $ \mathrm{D} $ 正确。

$ \mathrm{s}\mathrm{g}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 可指引 $ \mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 酶结合到特定的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列，它不是合成 $ \mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 酶的模板，该过程中 $ \mathrm{s}\mathrm{g}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的部分碱基序列可与靶基因特定部位的碱基序列互补配对， $ \mathrm{A} $ 、 $ \mathrm{B} $ 错误；由题意可知， $ \mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 酶的作用与限制酶类似，可在特定位点切割 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，使相应部位的核苷酸之间的磷酸二酯键断裂， $ \mathrm{C} $ 正确；基因编辑可能造成表达的蛋白质功能丧失，但不一定不能转录，故B 基因被编辑后可能依然可以转录，只是表达的蛋白质会改变， $ \mathrm{D} $ 错误。

目的基因两侧和质粒中均含有限制酶 $ XhoⅠ $ 、 $ NheⅠ $ 的识别序列，将目的基因插入质粒中时，可能用到限制酶 $ XhoⅠ $ 、 $ NheⅠ $ 切割目的基因和质粒，再用 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶将目的基因和质粒连接在一起， $ \mathrm{A} $ 正确；将目的基因导入受体细胞时，需要用 $ {\mathrm{C}\mathrm{a}}^{2+} $ 处理大肠杆菌，使其处于易吸收周围环境中 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的状态， $ \mathrm{B} $ 正确；按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子启动转录的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因， $ \mathrm{C} $ 错误；在含 $ \mathrm{X}-\mathrm{g}\mathrm{a}\mathrm{l} $ 的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌， $ \beta - $ 半乳糖苷酶基因编码产生的 $ \beta - $ 半乳糖苷酶可分解 $ \mathrm{X}-\mathrm{g}\mathrm{a}\mathrm{l} $ 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色， $ \mathrm{D} $ 正确。

如果两种限制酶在载体上识别序列相同，则用两种酶切割与用一种酶切割产生的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段应该相同，与图示结果不符，因而可推测两种限制酶识别的序列不相同， $ \mathrm{A} $ 正确。当仅用 $ \mathrm{R}1 $ 或 $ \mathrm{R}2 $ 一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，因此该载体最有可能为环状 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子；当用两种限制酶同时切割时，则产生两种不同长度的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，推测两种限制酶在载体上可能各有一个酶切位点， $ \mathrm{B} $ 正确。该载体可能为环状 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子，且长度为 $ 800\mathrm{b}\mathrm{p} $ ,两种限制酶同时切割时产生 $ 600\mathrm{b}\mathrm{p} $ 和 $ 200\mathrm{b}\mathrm{p} $ 两种长度的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，所以两种限制酶的切割位点最短相距约为 $ 200\mathrm{b}\mathrm{p} $ ， $ \mathrm{C} $ 正确。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子在凝胶中的迁移速率与 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子大小、构象、凝胶的浓度等有关， $ \mathrm{D} $ 错误。

（1） $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 是一项根据 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 半保留复制的原理，在体外提供参与 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，其过程一般可分为变性、复性、延伸三步。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子是由两条链按反向平行方式盘旋成的双螺旋结构， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的每条单链都具有两个末端，有一个游离的磷酸基团的一端为 $ 5\prime $ 端，另一端有一个羟基 $ (—\mathrm{O}\mathrm{H}) $ ，称作 $ 3\prime $ 端，而且 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的 $ 3\prime $ 端。据此分析并据图1可知， $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 过程应选择的引物是 $ Ⅱ $ 、 $ Ⅲ $ ，引物的作用是使 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶能够从引物的 $ 3\prime $ 端开始连接脱氧核苷酸。

（2） 在 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因两端设计不同黏性末端，其目的是在构建基因表达载体时，防止 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因自身环化，保证 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因与质粒正向连接。质粒中氨苄青霉素抗性基因属于基因工程中的标记基因，标记基因的作用是便于重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的筛选。

（3） 分析图2可知， $ BglⅡ $ 酶切出的黏性末端的碱基序列能够与 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因右侧的黏性末端的碱基序列互补配对， $ XmaⅠ $ 酶切出的黏性末端与 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因左侧的黏性末端相同，而 $ SmaⅠ $ 酶切出的末端为平末端，无法与 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因的黏性末端连接。 $ NheⅠ $ 酶切出的黏性末端无法与 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因的黏性末端互补配对。综上分析，为实现质粒和 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因的高效连接，切割质粒时选用限制酶 $ XmaⅠ $ 而不选用限制酶 $ SmaⅠ $ 。为将 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因连接到质粒上，还需要用 $ BglⅡ $ 切割质粒，再用 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶将切割后的质粒与 $ \mathrm{M} $ 蛋白基因连接。

（1） 由 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 获得 $ \mathrm{c}\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的过程为逆转录，此过程需要逆转录酶的催化。 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 转录为 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 时，基因中内含子相对应的序列会被剪切，启动子和终止子等非编码序列没有被转录。以花生细胞的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 通过逆转录过程获得的 $ \mathrm{c}\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，不含内含子、启动子和终止子等非编码序列，因此，通过逆转录获得的 $ S $ 基因与花生细胞中的 $ S $ 基因的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列不完全一致。

（2） 用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增 $ S $ 基因时，需要设计引物，引物的作用是使 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶能够从引物的 $ 3\prime $ 端开始连接脱氧核苷酸。为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的 $ 5\prime $ 端添加限制酶的识别序列。

（3） 依据图示可知，选用 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 会破坏目的基因，而 $ SalⅠ $ 的酶切位点不在 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中，选用 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ （在 $ S $ 基因的左右两侧均有酶切位点）可能导致错误连接，再根据 $ S $ 基因的转录方向可知，只有选用 $ XbaⅠ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 切割 $ S $ 基因的 $ \mathrm{c}\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 和载体，才能确保目的基因插入载体中方向正确。用农杆菌侵染水稻叶片外植体，是利用了农杆菌的侵染特性，通过农杆菌的转化作用，使目的基因能进入水稻细胞并整合到其染色体 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上。

（4） 转基因水稻是否表现出抗性，需要进行个体生物学水平的鉴定，鉴定的方法是对转基因水稻植株接种相应的真菌，观察其是否患稻瘟病。

（1） $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子的热稳定性与碱基对中的氢键数量有关， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中 $ \mathrm{G} $ 和 $ \mathrm{C} $ 之间有三个氢键， $ \mathrm{A} $ 和 $ \mathrm{T} $ 之间只有两个氢键， $ \mathrm{G}—\mathrm{C} $ 碱基对含量越多， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 越稳定，变性时所需温度越高。 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增需要2种引物，以 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的两条单链为模板，利用四种脱氧核苷酸为原料，在耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶的作用下合成子链。

（2） 在第一次 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 反应中，至少需要经过2个循环才形成图示大引物。第一次 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 的产物 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的一条链作为第二次 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 所用的引物。与 $ \mathrm{X} $ 射线诱变相比，该突变技术的优点是目的性强、突变概率高。

（3） 如果要利用微生物进一步克隆 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 定点诱变产物，其步骤包括：目的基因与载体结合、将重组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 导入受体细胞、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。