专题4 PCR技术

1．疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫 $ pfcrt $ 基因编码的蛋白在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。研究人员设计了 $ F1 $ 、 $ \mathrm{F}2 $ 、 $ \mathrm{R}1 $ 和 $ \mathrm{R}2 $ 四种备选引物用于扩增目的基因片段，如图1所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 为模板进行 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ ，产物的电泳结果如图2所示。下列叙述错误的是（      ）

图1图2

A． $ \mathrm{F}1 $ 、 $ \mathrm{F}2 $ 、 $ \mathrm{R}1 $ 和 $ \mathrm{R}2 $ 四种备选引物是根据 $ pfcrt $ 基因序列设计的

B．在 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 反应体系中需加入一定量的 $ {\mathrm{M}\mathrm{g}}^{2+} $ ，以激活耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶

C．由图2电泳结果可知，能用于特异性扩增 $ pfcrt $ 基因的引物为 $ \mathrm{F}1 $ 、 $ \mathrm{R}1 $ 、 $ \mathrm{R}2 $

D．若 $ pfcrt $ 基因扩增了4次，则共消耗引物30个

2．如图为利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增特定 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段的部分示意图，图中引物为单链 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是（      ）

A．利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶

B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的 $ 3\prime \to 5\prime $ 方向延伸

C．在第三轮循环产物中两条脱氧核苷酸链等长的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段占 $ \dfrac{1}{2} $

D．理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段占 $ \dfrac{15}{16} $

3．重组 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术是一项新的 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术，通过重组 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术能将两个不同的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接成为一个新 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到 $ LTB $ 和 $ ST1 $ 两个基因片段，利用重组 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术构建了 $ LTB-ST1 $ 融合基因，制备过程如图1所示。图2是 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增后的电泳结果，下列说法错误的是（      ）

A． $ LTB $ 和 $ ST1 $ 基因能够融合的关键之一是引物P2、P3的部分区域能进行碱基互补配对

B． $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的 $ 3\prime $ 端才能保证扩增顺利进行

C．图1中②过程的反应体系中不用额外加入引物

D． $ LTB-ST1 $ 融合基因最可能是图2中的条带3

4．农杆菌 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒上的 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ （序列已知）可以转移并随机插入被侵染植物的染色体 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中。研究者将图1中被侵染植物的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段连接成环，并以此环为模板，利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增出 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入位置两侧的未知序列，进一步分析可确定 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入的具体位置。 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的序列如图2所示，虚线处省略了部分核苷酸序列。已知 $ Sal $ Ⅰ酶的识别序列为 $ 5\prime -\mathrm{G}↓\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}-3\prime $ 。回答下列问题：

（1） $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增时起关键作用的酶是                      ，其作用是                                                      。

（2） 扩增出 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入位置两侧的未知序列时，需要先根据                            设计两种特异性引物序列，利用图中的引物    组合可扩增出 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 两侧的未知序列。

（3） 若只使用一种引物，通过 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术制备与 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的 $ \mathrm{b} $ 链相同的单链作为某些检测的探针，则所选择引物由 $ 5\prime \to 3\prime $ 的前5个碱基序列为                。

（4） 对 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 产物测序，经分析得到了图1中的未知序列。下列 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），可能正确的是    。

A． $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\cdots \cdots \mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}-3\prime $

B． $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}-3\prime $

C． $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\cdots \cdots \mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{A}-3\prime $

D． $ 5\prime -\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{C}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}-3\prime $

（5） $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增出 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入位置两侧的未知序列后，扩增产物可用              技术进行鉴定。

5．为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，科研人员运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。

图1

（1） 分别进行 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增片段 $ {\mathrm{F}}_{1} $ 与片段 $ {\mathrm{F}}_{2} $ 时，配制的两个反应体系中不同的有        。

（2） 有关基因序列如图2所示，引物 $ {\mathrm{F}}_{2}-\mathrm{F} $ 、 $ {\mathrm{F}}_{1}-\mathrm{R} $ 应在下列选项中分别选用          。

图2

A. $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{A}-3\prime $

B. $ 5\prime -\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}-3\prime $

C. $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G}-3\prime $

D. $ 5\prime -\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{C}-3\prime $

（3） 将 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。与传统构建重组载体的方法相比，这一操作无需使用的酶主要有                    。

（4） 为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物 $ {\mathrm{F}}_{1}-\mathrm{F} $ 和 $ {\mathrm{F}}_{2}-\mathrm{R} $ 进行了 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有    。

图3

（5） 对于 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是                                                      。