专题5 基因表达载体的构建

1．反义 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 可以通过与目标基因的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 形成互补双链而抑制基因表达。番茄果实在成熟过程中，多聚半乳糖醛酸酶分解果皮细胞壁上的多聚半乳糖醛酸，使果实变软，不耐贮藏。为了获得耐贮藏的番茄，使用多聚半乳糖醛酸酶基因片段（图1）和载体（图2），结合反义 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的作用原理，利用转基因技术获得耐贮藏的番茄。已知图中标识的各种限制酶切割产生的黏性末端之间不能互补配对。从多聚半乳糖醛酸酶基因中获得一段 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，并将这一片段反向插入载体中，最好选用的限制酶组合是（      ）

 

    

图1     图2

A． $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 和 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $

B． $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 和 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $

C． $ Pst $ Ⅰ和 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $

D． $ Not $ Ⅰ和 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $

2．同源重组是碱基序列基本相同的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如图甲所示。酿酒酵母基因组有多个 $ \mathrm{A}\mathrm{B} $ 短序列。为了通过同源重组将外源基因插入 $ \mathrm{A}\mathrm{B} $ 之间，在设计表达载体时，可采用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术在外源基因两端分别引入A和B，获得图乙所示长片段。下列有关分析正确的是（      ）

 

    

甲     乙

A． $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 时需加入大量外源目的基因作模板

B． $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 时需加入足量且等量的引物P2和P5

C．构建表达载体时会用到 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 酶和耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶

D．要实现定点插入还需要导入基因识别工具

3．生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。图1是通过基因工程将人的生长激素基因A导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2是基因工程中所用到的质粒，图3是通过 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 获取和扩增目的基因。请回答下列问题：

 

    

图1     图2

    

图3    

（1） 使用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术获取和扩增A基因， $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术要在缓冲体系中添加模板、4种脱氧核苷酸、两种引物、        、                      等。

扩增目的基因时，需要从图3中选择的一对引物是            。

（2） 要使A基因能正确与图2中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的      端分别增加相应的限制酶识别序列。分析图2和图3，若使用“双酶切”法同时处理质粒和目的基因，需在目的基因的上、下游分别添加        、          （填限制酶）的识别序列。用“双酶切”法同时处理质粒和目的基因的优点是                                                          。

（3） 图3中的基因表达时，    （填“ $ \mathrm{a} $ ”或“ $ \mathrm{b} $ ”）链作为转录的模板链。

4．我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源 $ vgb $ 基因定向插入 $ 19T-pflB $ 质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图1。请回答下列问题。

图1

（1） 图1中步骤①利用已构建的质粒 $ 19T-pflB $ ，通过反向 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 获得左右同源片段，除图1中已有的组分外，还应添加缓冲液（含 $ {\mathrm{M}\mathrm{g}}^{2+} $ ）、                                      （答两点）等。如表为 $ pflB $ 基因序列和设计的相关引物，可选用的引物是    （填编号）。

	$ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
$ pflB $ 基因	$ 5\prime -\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\cdots \cdots $ $ \mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}-3\prime $ $ 3\prime -\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{A}\cdots \cdots $ $ \mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}-5\prime $
$ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 引物	① $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C} $ $ \mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}-3\prime $ ② $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C} $ $ \mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}-3\prime $ ③ $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G} $ $ \mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}-3\prime $ ④ $ 5\prime -\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G} $ $ \mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{A}-3\prime $

注：下划线标注为 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 识别序列 $ (5\prime -\mathrm{G}↓\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}-3\prime ) $ 和 $ Pst $ Ⅰ识别序列 $ (5\prime -\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}↓\mathrm{G}-3\prime ) $

（2） 图1中步骤②双酶切时，需使用的限制酶 $ \mathrm{a} $ 和限制酶 $ \mathrm{b} $ 分别是        和        ，影响 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、 $ \mathrm{p}\mathrm{H} $ 、酶浓度和                                    （答出两点）等。

（3） 图2是质粒 $ PNZTK-PFTF-vgb $ 转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。

图2

将受体菌接种在含四环素和    （填“含”或“不含”）卡那霉素的培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图3所示。其中在两种培养基中均能生长的菌株是只发生单交换或        的受体菌。

图3

（4） 科学家通过分析 $ vgb $ 基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。分析时需要以 $ rpsE $ 基因（核糖体 $ \mathrm{S}5 $ 蛋白基因）为参照，该基因表达的特点是                          。

5．基因敲除又称基因打靶，其原理如图所示：将构建好的打靶质粒导入特定细胞，打靶质粒上的 $ \mathrm{A}\prime $ 、 $ \mathrm{B}\prime $ 序列分别与细胞基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上的A、B序列发生交换（同源重组），使得目的基因被阳性标记基因替换，从而实现目的基因的敲除。已知同源重组的发生概率较低，也可能偶尔发生非同源重组（此时阳性和阴性标记基因均插入基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，而目的基因也仍在基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上）导致基因敲除失败，阳性和阴性标记基因均只有位于基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 上时才能表达。

（1） 将打靶质粒导入特定动物细胞的方法是        。动物细胞减数分裂过程中，可能发生类似上述阳性标记基因替换目的基因的过程，推测应在                  （填时期）。

（2） 现有两种标记基因：新霉素抗性基因 $ (neo{}^{\mathrm{R}}) $ 和疱疹病毒胸苷激酶基因 $ (HSV-tk) $ 。导入新霉素抗性基因后，动物细胞对 $ \mathrm{G}418 $ （氨基糖苷类抗生素）有抗性，未导入的没有抗性； $ HSV-tk $ 的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞。在设计打靶质粒时，应以                        作为阳性标记基因，以                                作为阴性标记基因。在培养基中添加                  ，以此筛选出基因敲除成功的细胞。

（3） 成纤维生长因子 $ 1(\mathrm{F}\mathrm{G}\mathrm{F}1) $ 是一种内源性蛋白类激素，研究表明 $ \mathrm{F}\mathrm{G}\mathrm{F}1 $ 具有降低血糖的作用。 $ \mathrm{F}\mathrm{G}\mathrm{F}1 $ 可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能具有直接降低血糖水平的作用。欲设计实验探究 $ \mathrm{F}\mathrm{G}\mathrm{F}1 $ 降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的                        作为模型小鼠进行实验。

6．黑水虻是重要的资源昆虫，体内 $ \mathrm{H} $ 基因编码的抗菌肽 $ \mathrm{H}\mathrm{I}-3 $ 具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员利用酵母菌生产抗菌肽 $ \mathrm{H}\mathrm{I}-3 $ ，并避免基因污染。请回答下列问题：

（1） $ \mathrm{H} $ 基因编码链的编码区序列是 $ 5\prime -\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{G}\cdots \cdots \mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{A}-3\prime $ ，扩增 $ \mathrm{H} $ 基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是            （方向为 $ 5\prime \to 3\prime $ ，写出 $ 5\prime $ 端8个碱基序列）。获得 $ \mathrm{H} $ 基因产物后需要进行              ，将符合要求的条带切割回收以便提取纯化并进行测序。

（2） 由于抗菌肽 $ \mathrm{H}\mathrm{I}-3 $ 会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达） $ \mathrm{H} $ 基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽 $ \mathrm{H}\mathrm{I}-3 $ 对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中插入 $ \mathrm{P} $ 和 $ \mathrm{S} $ 基因，使质粒上 $ \mathrm{H} $ 基因的表达受红光控制。红光调控 $ \mathrm{H} $ 基因表达的原理如图1所示。

图1

$ \mathrm{P} $ 和 $ \mathrm{S} $ 基因表达应为        （填“组成型表达”或“红光诱导型表达”）。红光调控 $ \mathrm{H} $ 基因表达的原理是 $ \mathrm{S} $ 基因指导合成的 $ \mathrm{S} $ 蛋白直接与启动子 $ \mathrm{J}\mathrm{u}\mathrm{b} $ 结合， $ \mathrm{P} $ 基因表达的 $ \mathrm{P} $ 蛋白在红光调控下                                ，启动 $ \mathrm{H} $ 基因的表达。启动子是          酶识别和结合的位点。

（3） 发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的 $ \mathrm{F} $ 蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成 $ \mathrm{E} $ 蛋白的基因 $ (\mathrm{E}1 $ 、 $ \mathrm{E}2) $ ，使 $ \mathrm{F} $ 基因的表达受到蓝光控制，如图3。

 

    

图2     图3

图3中 $ \mathrm{E}2 $ 基因持续性表达少量的 $ \mathrm{E} $ 蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力， $ \mathrm{E}1 $ 基因的作用是蓝光照射后，                                                。

（4） 制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因 $ (\mathrm{T} $ 和 $ \mathrm{L}) $ 和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因 $ \mathrm{N} $ 的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。

图4

若图4中①选用的启动子为 $ \mathrm{J}\mathrm{u}\mathrm{b} $ ，②处选用的启动子为 $ \mathrm{C}\mathrm{Y}\mathrm{C} $ ，则③④处结合的阻遏蛋白分别为                  。

（5） 请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽 $ \mathrm{H}\mathrm{I}-3 $ 各阶段需控制的光照条件是Ⅰ菌种培养阶段：    ；Ⅱ菌种发酵阶段：        ；Ⅲ产物分离阶段：        ；Ⅳ安全处理阶段：红光、蓝光同时照射。