1．野生大豆的 $ SAMS $ 基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱能力，研究者将野生大豆的 $ SAMS $ 基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（ ）
A．图示过程使用了农杆菌转化法
B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基
C．Ⅰ中的筛选可使用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术
D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力
答案：D
解析：转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，图示过程使用了农杆菌转化法， $ \mathrm{A} $ 正确；Ⅰ中筛选含目的基因的农杆菌，需使用固体培养基，Ⅲ为植物组织培养的再分化过程，需要使用固体培养基， $ \mathrm{B} $ 正确； $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术可用于目的基因和基因表达载体的筛选， $ \mathrm{C} $ 正确； $ SAMS $ 基因具有提高抗逆性的作用，获得的转基因水稻幼苗不一定都具有抗盐碱的能力，还需要将转基因水稻置于盐碱环境中进行鉴定， $ \mathrm{D} $ 错误。
2．果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图如下。回答下列问题：
（1） 科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，通过设计引物扩增出大量果胶甲酯酶基因片段，在扩增过程中4种 $ \mathrm{d}\mathrm{N}\mathrm{T}\mathrm{P} $ 的作用是 ，此过程缓冲液中加入 $ {\mathrm{M}\mathrm{g}}^{2+} $ 的目的是 。在构建重组表达载体过程中，果胶甲酯酶基因应插入质粒的 之间才能进行表达。
（2） 可提取农杆菌的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 进行 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 后再通过 判断重组表达载体是否导入农杆菌。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原—抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉 ，判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，所以科研小组通过一定的方法将这种蛋白质的基因 ，从而获得高纯度的果胶甲酯酶。
（3） 发酵过程需保持 （至少写两点）、适宜 $ \mathrm{p}\mathrm{H} $ 、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。发酵结束后将发酵液进行离心处理，取 进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。在分离过程中使用一定浓度的硫酸铵处理发酵液后获得有活性的果胶甲酯酶沉淀物，原因是在一定浓度的硫酸铵条件下 、 。
答案：（1） 提供原料和能量；激活 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶；启动子和终止子
（2） 琼脂糖凝胶电泳；单位时间水解的果胶量；敲除
（3） 营养供给充分、适宜温度；上清液；果胶甲酯酶溶解度低；酶的空间结构不会被破坏
解析：（1） $ \mathrm{d}\mathrm{N}\mathrm{T}\mathrm{P} $ 是脱氧核苷三磷酸，可以为 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 提供原料和能量，缓冲液中加入 $ {\mathrm{M}\mathrm{g}}^{2+} $ 的目的是激活 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶。基因表达必须有启动子和终止子，因此目的基因必须插入启动子和终止子之间。
（2） 琼脂糖凝胶电泳可以检测 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，通过与标准 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 对照，判断是否存在对应的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 。获得转果胶甲酯酶基因的黑曲霉后，通过抗原—抗体杂交技术或检测单位量的转基因黑曲霉单位时间水解的果胶量，判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶酶相似，造成提取产物纯度不高，可以将该蛋白对应的基因敲除，使得该蛋白无法合成，从而获得高纯度的果胶甲酯酶。
（3） 发酵过程需保持营养供给充分、适宜温度、适宜 $ \mathrm{p}\mathrm{H} $ 、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。发酵结束后将发酵液进行离心处理后，果胶甲酯酶存在于上清液中，故取上清液进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。从获得“有活性的果胶甲酯酶沉淀物”可知，果胶甲酯酶在一定浓度的硫酸铵中溶解度低且该条件下不会破坏酶的空间结构。
3．我国科学家利用 $ \mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{S}\mathrm{P}\mathrm{R}/\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 基因编辑技术和体细胞核移植 $ (\mathrm{S}\mathrm{C}\mathrm{N}\mathrm{T}) $ 技术，成功构建了世界首例体细胞 $ BMAL1 $ 基因（产生昼夜节律必需的基因）敲除的生物节律紊乱猕猴，为相关疾病研究提供了新型动物模型，其基本构建流程如图所示。 $ \mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{S}\mathrm{P}\mathrm{R}/\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 基因编辑系统能在 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 特定位置进行切割，被切割的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 修复时会发生基因突变而导致靶基因失活，第一代 $ BMAL1 $ 基因敲除猴的5只个体表现出不同程度的节律紊乱症状。为进一步获得理想动物模型，研究团队采集 $ \mathrm{A}6 $ 个体的成纤维细胞，经 $ \mathrm{S}\mathrm{C}\mathrm{N}\mathrm{T} $ 后最终获得多只第二代 $ BMAL1 $ 基因敲除猕猴模型。请回答下列相关问题：
（1） 经 $ \mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{S}\mathrm{P}\mathrm{R}/\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 基因编辑和胚胎移植获得的第一代 $ BMAL1 $ 基因敲除猴的不同个体表现出不同程度的节律紊乱症状，原因是 。
（2） 实验中采集的卵母细胞通常在体外培养至 期，进行动物成纤维细胞体外培养时置于含有 气体的培养箱中。核移植成功后，用 （填具体方法，写出2种即可）激活重构胚。
（3） 为提高胚胎的发育率和妊娠率，研究人员还将组蛋白去甲基化酶 $ \mathrm{K}\mathrm{d}\mathrm{m}4\mathrm{d} $ 的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 注入了重组融合细胞，推测 $ \mathrm{K}\mathrm{d}\mathrm{m}4\mathrm{d} $ 的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的作用是 。
（4） 与第一代 $ BMAL1 $ 基因敲除猴模型相比，第二代猕猴模型用于研究生物节律紊乱及相关药物研发的优势是 （写出1点即可）。
答案：（1） $ \mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{S}\mathrm{P}\mathrm{R}/\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 对不同个体的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 特定位置进行切割，被切割的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 修复时最终导致的基因突变不同
（2） $ \mathrm{M}Ⅱ $ （或减数分裂Ⅱ中）； $ 95\% $ 空气和 $ 5\%{\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2} $ 的混合；电刺激、 $ {\mathrm{C}\mathrm{a}}^{2+} $ 载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等
（3） 降低组蛋白的甲基化程度，有利于与细胞分裂和分化相关基因的表达
（4） 遗传背景一致
解析：（1） $ \mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{S}\mathrm{P}\mathrm{R}/\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{s}9 $ 对不同个体的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 特定位置进行切割，被切割的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 修复时最终导致的基因突变不同，所以不同个体表现出不同程度的节律紊乱症状。
（2） $ \mathrm{M}Ⅱ $ 期卵母细胞才具备受精能力，且细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质和营养条件，因此实验中采集的卵母细胞通常在体外培养至 $ \mathrm{M}Ⅱ $ 期；进行动物成纤维细胞体外培养时置于含有 $ 95\% $ 空气和 $ 5\%{\mathrm{C}\mathrm{O}}_{2} $ 的混合气体的培养箱中。核移植成功后，用电刺激、 $ {\mathrm{C}\mathrm{a}}^{2+} $ 载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等激活重构胚。
（3） 组蛋白去甲基化酶 $ \mathrm{K}\mathrm{d}\mathrm{m}4\mathrm{d} $ 的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 经翻译产生组蛋白去甲基化酶，可以降低组蛋白的甲基化程度，有利于与细胞分裂和分化相关基因的表达。
（4） 第二代基因敲除猴是由 $ \mathrm{A}6 $ 的成纤维细胞进行克隆获得的，因此它们的基因组成相同。与第一代 $ BMAL1 $ 基因敲除猴模型相比，第二代猕猴模型用于研究生物节律紊乱及相关药物研发的优势是遗传背景一致。
4．基因 $ X $ 的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含 $ X $ 的基因表达载体（图1），并导入大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题：
图1
（1） 基因表达载体通常含有目的基因、启动子、 、 、 等结构；构建含 $ X $ 的基因表达载体时，应选择图1中的 （填限制酶）。
（2） 酶切后的载体和基因 $ X $ 进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连、基因 $ X $ 与载体正向连接、基因 $ X $ 与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种产物，选择 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 酶和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中2泳道对应的载体的连接方式是 。
图2
（3） 在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为 。
（4） 将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因 $ X $ 是否转录出 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，可用 技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
（5） 科学家使用转基因动物生产药物时通常将药用蛋白基因与 等调控组件重组在一起导入哺乳动物的细胞中，使转基因动物通过分泌乳汁来生产药物，此转基因动物被称作 。
答案：（1） 终止子；复制原点；标记基因； $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $
（2） 反向连接
（3） 细胞贴壁
（4） $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ ；传代
（5） 乳腺中特异表达的基因的启动子；乳腺生物反应器
解析：（1） 基因表达载体通常含有目的基因、启动子、终止子、复制原点、标记基因等结构。根据题意和图示分析可知，由于 $ X $ 基因两边都有 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 限制酶识别序列，载体也含有该限制酶识别序列，所以构建含 $ X $ 基因的表达载体时，应选择图1中的 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 限制酶进行酶切。
（2） 见题图解读。
（3） 进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。在适宜环境中培养，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
（4） 将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，可用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 等技术检测基因 $ X $ 是否转录出 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 。当培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，需要换瓶，然后进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
（5） 利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。