第3章素养检测

1．水蛭素可用于预防和治疗血栓。研究发现，将水蛭素第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，其抗凝血活性显著提高，可通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素。下列相关叙述正确的是（      ）

A．对水蛭素进行改造的直接操作对象为已有的水蛭素

B．改造好的水蛭素基因可以直接用显微注射法导入奶牛的受精卵中

C．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起

D．水蛭素基因及其 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 只能从转基因奶牛的乳腺细胞中提取并检测

2．菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜而影响植株生长。某科研团队获得了转 $ GNA $ 基因（表达产物能有效抑制桃蚜生长）菊花，流程如图所示。下列相关叙述错误的是（      ）

A．过程 $ \mathrm{a} $ 、 $ \mathrm{b} $ 分别表示逆转录和 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ ，可获得大量 $ GNA $ 基因

B．上述基因工程用到的 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒不需要进行人工改造

C．图中 $ \mathrm{c} $ 过程需要将 $ GNA $ 基因插入 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒的 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 中

D．通过桃蚜接种实验可以检测图中菊花植株对桃蚜的抗性

3．乙肝基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中 $ LacZ $ 基因可使细菌产生能够分解 $ \mathrm{X}-\mathrm{g}\mathrm{a}\mathrm{l} $ 的酶，从而使菌落呈现蓝色，若无该基因，则菌落呈白色。下列叙述错误的是（      ）

A．过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度等有关

B．过程②需要在培养基中加青霉素和 $ \mathrm{X}-\mathrm{g}\mathrm{a}\mathrm{l} $ ，以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落

C．大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原—抗体杂交法进行检测

D．该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高

4．研究者构建了如图所示的双质粒表达系统，当色氨酸缺乏时 $ {P}_{\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{p}} $ 启动子开启，而色氨酸充足时 $ {P}_{\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{p}} $ 启动子关闭。下列表述错误的是（      ）

A．培养基中缺少色氨酸时，阻遏蛋白 $ \mathrm{c}\mathrm{l} $ 合成

B．阻遏蛋白 $ \mathrm{c}\mathrm{l} $ 与 $ {P}_{\mathrm{L}} $ 启动子结合，目的基因转录关闭

C．培养基中富含色氨酸时，目的基因表达水平下降

D．调节培养基中色氨酸含量能控制目的基因表达水平

5．剔除转基因生物中的标记基因，可减少生物安全问题带来的疑虑。如图是利用双 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 表达载体系统培育无标记基因转基因大豆的基本流程。下列叙述错误的是（      ）

注： $ D6D $ 为目的基因， $ bar $ 为标记基因；两个 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段随机插入大豆细胞染色体中，每个片段只插入一次，且不考虑基因突变、染色体变异和染色体互换等

A．该双 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 表达载体中既包含复制起点，又包含适当的转录和翻译信号

B．若两个 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入同一条染色体中，通过自交无法筛选出符合要求的植株

C．若两个 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入同源染色体中，则 $ {\mathrm{F}}_{1} $ 中含 $ D6D $ 不含 $ bar $ 的植株占 $ \dfrac{1}{4} $

D．若两个 $ \mathrm{T}-\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 插入非同源染色体中，则 $ {\mathrm{F}}_{1} $ 中含 $ D6D $ 不含 $ bar $ 的植株占 $ \dfrac{3}{8} $

6．草莓果实采后难以保鲜是生产中的难题。乙烯在调控果实成熟基因的协同表达中起着非常重要的作用。研究人员通过反义 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 技术抑制乙烯受体基因 $ Ersl $ 的表达，达到延长储藏期的效果。 $ \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{B} $ 法提取草莓叶片 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的部分实验步骤如图1。请回答下列问题：

图1

（1） $ \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{B} $ 提取液中含有 $ \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{B} $ 、 $ \mathrm{E}\mathrm{D}\mathrm{T}\mathrm{A} $ 、 $ \mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{C}\mathrm{l} $ 等物质， $ \mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{B} $ 能破坏膜结构，使蛋白质变性，使核酸分离出来； $ \mathrm{E}\mathrm{D}\mathrm{T}\mathrm{A} $ 是一种 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 酶抑制剂，加入 $ \mathrm{E}\mathrm{D}\mathrm{T}\mathrm{A} $ 的目的是                。氯仿、异戊醇密度均大于水且不溶于水， $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 不溶于氯仿、异戊醇，而蛋白质等杂质可溶，实验中加入氯仿、异戊醇离心后，应取      （填“上清液”“中层溶液”或“沉淀”），该步骤重复 $ 1\sim 2 $ 次，继续进行图1中后面两个步骤就可得到 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 粗提取物。

（2） 通过上述方法获得的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 经进一步提纯后，通过 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增 $ Ersl $ 。在 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 体系中，加入的 $ \mathrm{d}\mathrm{N}\mathrm{T}\mathrm{P} $ （四种脱氧核苷三磷酸， $ \mathrm{N} $ 表示碱基 $ \mathrm{A}/\mathrm{T}/\mathrm{C}/\mathrm{G} $ ）可为 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的复制提供        ，耐高温的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶需要        激活，添加引物的序列不能过短，否则会导致其特异性    （填“降低”或“升高”）。

（3） 为使目的基因与质粒连接，在设计 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 引物扩增 $ Ersl $ 时，需在引物的      端添加限制酶 $ Xho $ Ⅰ的识别序列。经 $ Xho $ Ⅰ酶切后的质粒和 $ Ersl $ 进行连接（如图2），连接产物经筛选得到的质粒主要有                                                                            三种类型。为鉴定这些连接方式，选择 $ Hpa $ Ⅰ和 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 对筛选的重组质粒进行双酶切，并对酶切后的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段进行电泳分析。若电泳结果出现长度约为                            的片段，该重组质粒即为所需的基因表达载体。

图2

（4） 将筛选得到的重组质粒与用        处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，在含      的培养基中培养，筛选所需的植物细胞，再利用            技术，最终得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是                                                                        。

7．人血清白蛋白 $ (\mathrm{H}\mathrm{S}\mathrm{A}) $ 具有重要的医用价值，研究人员欲用转基因牛来大量生产 $ \mathrm{H}\mathrm{S}\mathrm{A} $ 。图1所示为 $ HSA $ 基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒 $ \mathrm{p}\mathrm{B}\mathrm{R}322 $ ，图中 $ Am{p}^{\boldsymbol{R}} $ 表示氨苄青霉素抗性基因， $ Ne{o}^{\boldsymbol{R}} $ 表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。请据图回答问题：

（1） 人工构建 $ \mathrm{p}\mathrm{B}\mathrm{R}322 $ 质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有            （答出两点）等。

（2） 若选用牛作为受体动物，可用        作为受体细胞，通过        法将目的基因导入受体细胞中，然后使其发育成转基因牛。

（3） 据图1分析，在构建基因表达载体时，与单独使用 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 相比，选择 $ Eco\boldsymbol{R}Ⅰ $ 和 $ Pst $ Ⅰ作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体正确连接的效率，其原因是                                                                                      。

（4） 为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入 $ \mathrm{p}\mathrm{B}\mathrm{R}322 $ 质粒而非重组质粒）的干扰，在目的基因导入后，需进行进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上    （填“能”或“不能”）生存，在乙培养基上    （填“能”或“不能”）生存。

（5） 据图2分析，利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术获取 $ HSA $ 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的    。

8．研究人员利用图中质粒构建基因表达载体并将其导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，以期解决胰岛素药源不足的问题。回答下列问题：

注：①图中几种限制酶的识别序列和切割位点为

$ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ ： $ 5\prime -\mathrm{G}↓\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}-3\prime $ ；

$ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ ： $ 5\prime -\mathrm{G}↓\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{C}-3\prime $ ；

$ Sma $ Ⅰ： $ 5\prime -\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{C}↓\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{G}-3\prime $ ；

$ Sal $ Ⅰ： $ 5\prime -\mathrm{G}↓\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{C}-3\prime $ 。

$ ②LacZ $ 基因编码产生的 $ \beta - $ 半乳糖苷酶可分解 $ \mathrm{X}-\mathrm{g}\mathrm{a}\mathrm{l} $ 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色，该方法称为“蓝白斑”法

    

图1     图2

（1） 先提取胰岛B细胞中的总 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，通过一定方法分离纯化出胰岛素基因的 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，经      过程得到 $ \mathrm{c}\mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ，然后设计引物并利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 的原因是                                    。

（2） 已知胰岛素基因的 $ \alpha $ 链为编码链。据图1分析，利用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增胰岛素基因时，需对引物①~④进行特殊处理。 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 所需的引物组合是    ，在其中一种引物的        （填“ $ 3\prime $ 端”或“ $ 5\prime $ 端”）需添加 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 识别序列和强启动子。1个胰岛素基因片段扩增4次，共需消耗引物    个。

（3） 为确保胰岛素基因正确插入图2的载体中，需选择的限制酶组合是                  。

已知胰岛素基因 $ \alpha $ 链的碱基序列为 $ 5\prime -\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{G}\mathrm{G}\cdots -3\prime $ ，强启动子的碱基序列为 $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{G}-3\prime $ ，请写出胰岛素基因上游引物的18个碱基序列： $ 5\prime - $                        $ -3\prime $ 。

（4） “蓝白斑”法是基因工程中常用的筛选方法。请简述将胰岛素基因导入大肠杆菌并筛选工程菌的过程：                                                                                                   。