素养提升集训1——基因工程中限制酶和引物的选取

据图可知，质粒中 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ 的酶切位点没有位于启动子和终止子之间，不能用于切割质粒； $ Mun $ Ⅰ的酶切位点位于质粒的启动子与终止子之间，但该限制酶会破坏目的基因，不能用于切割目的基因，这两种酶切割后产生的黏性末端相同，可在切割质粒时选 $ Mun $ Ⅰ，切割目的基因时选 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ ；同时要确保目的基因插入载体中时方向正确，由题干信息及目的基因结构可知， $ S $ 基因转录方向为从右向左，目的基因右侧有 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ 的切割位点，结合质粒上的限制酶酶切位置可知，目的基因右侧只能选用 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ ，目的基因左侧可选择 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ ，故选 $ \mathrm{B} $ 。

$ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，提取 $ SNAC1 $ 基因的过程中加入体积分数为 $ 95\% $ 的冷酒精是为了析出 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ ， $ \mathrm{A} $ 正确。已知转录时 $ \mathrm{m}\mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 自身的延伸方向为 $ 5\prime \to 3\prime $ ，启动子应与模板链的 $ 3\prime $ 端相连，故 $ SNAC1 $ 基因以 $ \mathrm{B} $ 链为转录模板链， $ \mathrm{B} $ 正确。 $ \mathrm{L}\mathrm{e}\mathrm{a}\mathrm{p} $ 启动子是一段有特殊结构的 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段，能被 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶识别并结合，驱动基因的转录；为使 $ SNAC1 $ 基因在普通水稻植株中超量表达，必须含有强启动子，结合质粒上终止子的位置，若选用限制酶 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 、 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ ，目的基因会反向插入载体，所以应选用限制酶 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 和 $ Kpn $ Ⅰ切割图中的 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒和 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段， $ \mathrm{C} $ 错误。重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故若将重组质粒导入农杆菌中，农杆菌培养基中需添加卡那霉素进行筛选， $ \mathrm{D} $ 正确。

一个 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 分子经 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增两次后的产物有4个， $ \mathrm{A} $ 错误； $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术中，复性是指引物结合到互补 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 链上，复性温度过高会使碱基之间的氢键不易形成，导致引物不能与模板链牢固结合，扩增效率下降， $ \mathrm{B} $ 正确；若引物之间的碱基可互补配对，则引物之间可能相结合，导致 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增失败， $ \mathrm{C} $ 正确；为方便构建基因表达载体，可在引物中增加合适的限制酶酶切位点，以便扩增出的目的基因能够被相应限制酶切割， $ \mathrm{D} $ 正确。

（1） 据图甲可知，目的基因中存在 $ Sma $ Ⅰ和 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ 两种限制酶的识别序列，若用这两种限制酶切割会破坏目的基因；为防止目的基因和质粒自身环化和反向连接，质粒和目的基因应该用 $ Xho $ Ⅰ、 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 切割。根据启动子方向以及终止子位置， $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 扩增启动子 $ \mathrm{S} $ 时，图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入 $ Xho $ Ⅰ、 $ Bam\mathrm{H}Ⅰ $ 的识别序列。

（2） $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶的作用是从引物的 $ 3\prime $ 端开始连接脱氧核苷酸，引物与模板链的 $ 3\prime $ 端结合，因此，扩增该基因的合适引物组合是 $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{T}\mathrm{C}-3\prime $ 、 $ 3\prime -\mathrm{G}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{G}\mathrm{G}-5\prime $ 。引物是根据目的基因两端的脱氧核苷酸序列设计的，故通过引物的设计，能做到选择性扩增 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 片段。

（1） 质粒能在受体细胞中复制依赖复制原点，因此 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒上与其在农杆菌中复制能力相关的结构为复制原点。 $ StPin1A $ 基因上无限制酶的识别序列，为了使扩增后的 $ StPin1A $ 基因能够与 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒上的 $ NaPI $ 基因正确连接，用 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 技术扩增 $ StPin1A $ 基因时，需要设计合适的引物，依据图1及表中信息推测， $ StPin1A $ 要连接到 $ NaPI $ 的后面形成融合基因，且转录模板链的 $ 3\prime $ 端应与启动子接近，切割 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒时需要用限制酶 $ Eco\mathrm{R}Ⅰ $ 和 $ Hin\mathrm{d}Ⅲ $ ，故引物P2包含的碱基序列为 $ 5\prime -\mathrm{G}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{G}-3\prime $ 。对获得的 $ NaPI-StPin1A $ 融合基因进行扩增，上游引物选P1，下游引物选P4。

（2） 融合基因启动子是 $ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 聚合酶识别和结合的部位，可驱动融合基因转录。为了使连接后的融合基因 $ NaPI-StPin1A $ 能够表达出融合蛋白，应剔除 $ NaPI $ 基因中终止密码子对应的碱基序列，确保融合蛋白能够连续翻译。

（3） $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒上存在卡那霉素抗性基因，将构建好的重组 $ \mathrm{T}\mathrm{i} $ 质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有卡那霉素的固体培养基上，选择生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养。在愈伤组织阶段取部分细胞提取总 $ \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A} $ 进行 $ \mathrm{P}\mathrm{C}\mathrm{R} $ 和凝胶电泳，此操作的目的是检测融合基因 $ NaPI-StPin1A $ 是否导入，由于 $ NaPI $ 基因长度为 $ 462\mathrm{b}\mathrm{p} $ ， $ StPin1A $ 基因长度为 $ 750\mathrm{b}\mathrm{p} $ ，融合基因长度大约为 $ 462+750=1212(\mathrm{b}\mathrm{p}) $ ，对照题图2电泳结果可知，其中成功导入融合基因 $ NaPI-StPin1A $ 的细胞是 $ \mathrm{C} $ 。